故事发生在 2004 年，即《生化危机 2》六年后，由于各新闻媒体争相报导 Umbrella 公司在莱肯市的地下研究所，制作的 T-病毒早前泄漏导致陷入生化的危机。连串的负面新闻导致公司股票价格笔直暴跌。美国联邦政府在各国政府的压力下暂停安布雷拉公司的业务，其后公司便宣告破产，所有地下研究中断，T-病毒的传播得以停止。
这次的主角是在《生化危机 2》中到莱肯市的警察，现在为美国总统直接统率的最高机密组织成员的里昂·斯科特·肯尼迪。里昂今次被派遣到欧洲某个（推测为西班牙或苏格兰）神秘村庄，受命拯救格林汉姆总统被拐去的女儿阿什莉·格林汉姆（Ashley Graham）。在拯救的途中他发现阿什莉的绑架者是一个神秘的宗教团体，名叫“Los Illuminados”（西班牙语：照亮的道路），教主是奥斯穆德·萨德勒（Osmund Saddler）。
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